生物组织由多种异质性细胞组成,单个细胞之间的差异可能会对多细胞生物的功能产生深远影响。近年来开发的单细胞RNA-seq技术可以对单个细胞进行无偏、可重复、高分辨率和高通量的转录分析。相对于传统的群体细胞的转录组分析,单细胞RNA-seq技术从另外一个维度了解转录组信息,揭示生物组织的细胞构成、转录组动力学以及基因间的调节关系。
方法/步骤
1、1撮劝丛食单细胞RNA-seq技术的建立与发展2009年,Tang等首次报道了在单个细胞中基于高通量测序的对mRNA转录组学完全无偏倚的研巨角脶芫究方法。2011年,Islam等建立了单细胞标记的逆转录测序方法,即STRT-seq(single-celltaggedreversetranscriptionsequencing),这是一个高度多路复用的方法,能够在逆转录过程中给每个细胞加上条形码,从而能够大规模检测各种混合细胞样本,如异质性很高的肿瘤细胞样本。在此之后,2012年由美国和瑞典的科学家共同开发了一种新的单细胞测序技术Smart-seq(switchingmechanismat5′endoftheRNAtranscript),这是一项具里程碑意义的技术。这种技术能够检测mRNA的全长,在转录本的序列覆盖度上有所改善。但这种方法的缺点是不具有链特异,具有转录本长度偏向性,对于超过4Kb的序列不能高效转录。此外,同一年,Hashimshony等开发出了另一种单细胞测序方法CEL-seq(cellexpressionbylinearamplificationandsequencing),此方法是一种采用线性扩增的测序方法,其线性扩增的主要优势是错误率比较低,扩增后DNA的双端深度测序能够准确检测两条链的序列。此方法添加条形码后混合实现了许多不同单细胞的多重分析和研究。这种方法的缺点是具有强烈的3′端偏好。2013年,Picelli等又将Smart-seq技术做了一些改进,新的技术称为Smart-seq2,在新技术中使用了锁核酸(lockednucleicacid)、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。它不再需要纯化步骤,可大大提高产量,但其只能对具有poly(A)尾巴的mRNA进行扩增和检测。随着技术的发展与完善,单细胞RNA-seq至此进入了高通量与自动化时代。到2017年后,10×Genomics公司和FredHutchinson癌症研究中心开发出一种新的单细胞RNA测序方法,可实现数千个免疫细胞的分析。10×Genomics平台基于微滴的核酸条形码分配系统,这个系统提供了数以百万级的携带唯一DNA条形码的微滴,通过微流控技术,将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中。凝胶珠在每个油滴内溶解,细胞裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA。液体油层破坏后,cDNA一分为二,后续同时进行基因表达和免疫组库文库构建。即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。天津生物芯片10×Genomics单细胞平台等大型平台，为客户提供高质量的数据，协助客户发表文章一千余篇，努力只为您的科研更加便利。
2、单细胞RNA-seq应用3.1胚胎发育在胚胎发育的早期阶段,受精卵会经历广泛的转录调节和表观遗传重编程过程,从而形成内胚层、中胚层和外胚层三个主要细胞群体。由于早期胚胎发育阶段细胞数量有限,这对于研究早期基因调控和细胞干性的维持是一个挑战。随着单细胞RNAseq技术的出现,Tang等首次分析了体外囊胚期内细胞团向多能胚胎干细胞转变过程中转录组重编程的过程。3.2组织器官发育在大多数组织中,传统的细胞分型是根据已有的细胞标记将细胞分入不同的群体中,这种方法受限于已知的几十个标记基因。单细胞RNA-seq技术则不依赖于已知的标记,而是通过分析单个细胞转录组精细地识别出各种细胞类型,同时能够发现新的细胞类型以及标记基因。3.3免疫系统免疫系统可以分为固有免疫和适应性免疫,由大量的各种各样的细胞类型所组成。这些细胞在体内协调分工,识别和清除外来抗原。由于这些细胞对于抗原的应答具有复杂的异质性,因此又可以被分为很多亚型。尽管一些主要的细胞类型已经被大家所熟知,但是在对抗原的反应中,大多数细胞类型的转录异质性仍然是不为人知的。3.4肿瘤研究肿瘤细胞是由正常细胞积累突变进化而来的,而由于肿瘤细胞之间基因突变或表达谱的不同,使瘤内细胞多样化形成不同类型或同一类型细胞中的不同亚型。这种肿瘤内部的异质性影响了患者的临床诊断和治疗。单细胞RNA-seq的方法为描述克隆多样性和了解罕见细胞在癌症进展过程中的所发挥的作用提供了强有力的新工具。虽然单细胞RNA-seq技术的应用仍然相对较新,但它已经对生物学许多领域产生了巨大的影响,极大地推进了我们对人类疾病的基本理解。随着单细胞RNA-seq相关方法变得更加精炼、更高通量、更廉价,未来几年该技术将在基础研究和临床实验中得到更广泛的使用。